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Presens传感器插头在微流体中的应用

点击次数:392 发布时间:2022-08-25

在这项研究中,我们假设传感器系统可用于小胶质细胞代谢的无创实时监测,以进一步阐明动态微环境下特定表型的极化水平。我们设计并制造了一种微流控芯片,用于在连续流动下培养小胶质细胞,并将氧气和 pH 值的变化与激活后的极化状态相关联。

炎症是由外来抗原、病原体和化学物质等刺激引发的一系列复杂事件。它在多种疾病中发挥关键作用,例如自身免疫性疾病、癌症和伤口愈合过程 [1]。巨噬细胞和小胶质细胞由于其抗原呈递、吞噬作用和免疫调节特性而分别在炎症和神经炎症中发挥重要作用 [2]。小胶质细胞作为巨噬细胞的一种亚型,在神经免疫反应中也像巨噬细胞一样发挥作用 [3]。根据它们在生理微环境中暴露的信号,小胶质细胞可以转化为两种不同的表型,称为 M1 和 M2 [4]。也称为“经典激活”的促炎 M1 小胶质细胞可以由脂多糖 (LPS) 诱导,而 IL-4 和 IL-13 诱导“交替激活”抗炎 M2 表型 [5,6]。为了响应对 M1 表型的刺激,已显示巨噬细胞和小胶质细胞中发生代谢变化。在 LPS 刺激期间,产生的一氧化氮 (NO) 会抑制氧化磷酸化,从而导致细胞转为糖酵解。由于这种反应,乳酸产量增加,这反过来又增加了细胞外酸化率 (ECAR)。监测 pH 值的变化可以深入了解细胞和组织的生理和代谢状态 [7]。小胶质细胞的极化状态通常可以通过基因表达、细胞表面标志物和释放到培养基中或在细胞外基质中积累的蛋白质来检测。在这方面PCR、流式细胞仪、ELISA 和 Western Blotting 是尤为常见的方法之一,它们具有侵入性、费力且耗时。这些技术也不能提供关于极化状态变化的洞察力和实时监测。体外 实验。微流控芯片上的器官系统通过为异质细胞群提供具有动态培养模型的 3D 分层架构,提供了出色的体外 平台来模拟复杂的器官/组织。先前已经报道了具有复杂病因的疾病的神经炎症模型,这进一步突出了生物工程微环境的优势[8]。

材料与方法

微流控芯片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制成,因为它具有柔韧性,便于插入传感器插头和密封泄漏。为了制造芯片的 PDMS 组件,PDMS 分别用 1:10 的固化剂和 PDMS 混合物浇铸在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上。在真空下脱气后,将模具在 80 ºC 下烘烤一小时,然后从模具中切出碎片。芯片 A 是一种混合芯片,包括 PMMA 和 PDMS 组件。芯片的底部包含一个用于 3D 培养和流体流动的通道,在这些层上带有一个 PDMS 层,带有入口、出口和传感器插头端口。有一个额外的 PMMA 层包围了芯片,为光缆提供结构支撑,从而促进螺栓的压缩。所有这些层都在 6 个螺栓的帮助下结合在一起(图 1C)。芯片 B 有两层。在软光刻之后,将制造的 PDMS 组件等离子结合到显微镜载玻片上。键合后,将这些芯片放置在 120°C 的热板上 2 小时以增强键合强度。

图 1:用于 3D 和 2D 小胶质细胞极化的两种不同制造的微流控芯片的图像。用于 3D 细胞培养的芯片 A 的设计:A) AutoCAD 图纸,尺寸以 [mm] 为单位,B) 芯片 A 从上到下的层数,C) 带有蓝色染料和传感器插头假人的芯片 A 的图像,芯片 B 的设计用于2D 细胞培养:D) 芯片 B 的尺寸,E) 芯片 B 的层数,F) 带有红色染料和传感器插头假人的芯片 B 的图像。 N9小鼠小胶质细胞系用于巨噬细胞极化实验。使用完全 RPMI(无酚)培养基 1640(补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/链霉素 (Pen/Strep))进行细胞扩增。将细胞培养至 80% 融合并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收获。用高细胞密度 (4.5 x 10 5细胞/cm 2 )接种乙醇灭菌的芯片,并在静态条件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育过夜。

一旦小胶质细胞粘附并形成单层培养物,就使用注射泵(哈佛仪器)以 0.5 µl/min 的连续流量进行管理(图 2)。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 将小胶质细胞极化为 M1 样表型 24 小时。在整个研究过程中,未刺激的细胞用作对照组。将微流控芯片放置在细胞培养箱中,并将传感器插头连接到光纤电缆。收集氧气和 pH 传感器测量值 24 小时。在数据采集过程中,没有打开培养箱以避免任何气体和温度波动。

图 2:实验装置:A) 连接到光纤仪表和计算机的传感器图像,B) 注射泵和芯片的图像,C) 培养箱内的芯片和连接的光缆。

图 2:实验装置:A) 连接到光纤仪表和计算机的传感器图像,B) 注射泵和芯片的图像,C) 培养箱内的芯片和连接的光缆。

在微流控芯片中动态培养 24 小时后,将含有 15 µM 二硫苏糖醇 (DTT) 的裂解缓冲液移液到通道中以裂解细胞。收集裂解物并储存在-80°C 用于 RNA 分离。使用 Macherey-Nagel RNA 分离试剂盒分离 RNA。通过 qPCR 分析根据其 TNFα、IL-6 和 iNOS 基因表达水平比较对照组和 M1 组。

在 24 小时孵育期间从微流控芯片出口收集的上清液用于 ELISA。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 试剂盒已根据制造商说明使用。为了验证我们的传感器读数并确认 M1 极化,我们确定了对照组和 M1 组释放的 TNFα 水平。

结果

溶解氧显示 LPS 刺激的小胶质细胞和未刺激的对照组减少。虽然在两种情况下都有类似的趋势,但在 24 小时的刺激期间,M1 极化小胶质细胞的氧水平低于对照。对于 LPS 刺激的细胞,对照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%(图 3A)。在 pH 监测芯片中,pH 水平在 24 小时内下降,其中对照的最终值为 6.8,LPS 刺激细胞的最终值为 6.5。

图 3:24小时刺激期间O 2和 pH 曲线的传感器数据。A) 对照和 LPS 刺激细胞的 O 2 % 变化,B) 对照和 LPS 刺激细胞的 pH 变化。

在 24 小时结束时对 TNFα、IL-6 和 iNOS 的基因表达分析显示了显着的倍数变化,证实了动态微流体培养下 LPS 刺激的小胶质细胞的 M1 极化。ELISA 测定表明从 LPS 刺激的细胞 (M1) 释放的 TNFα 细胞因子显着增加。在动态条件下 24 小时后的 TNFα 浓度测量为未刺激的对照为 102 pg/ml,LPS 刺激的小胶质细胞为 470 pg/ml。

图 4:对照和 LPS 刺激细胞的 mRNA 表达。A) 对照和 LPS 刺激细胞的 TNFα mRNA 表达,B) 对照和 LPS 刺激细胞的 IL-6 mRNA 表达,C) 对照和 LPS 刺激细胞的 iNOS mRNA 表达。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是从双尾学生 t 检验计算的。

图 5:从对照和 LPS 刺激的芯片出口收集的培养基的 TNFα 浓度水平 (pg/ml)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是从双尾学生 t 检验计算的。

讨论

本研究的最初目的是观察 3D 培养中极化过程中小胶质细胞发生的代谢变化。为此,我们设计并制造了用于 3D 动态培养的芯片 A,并刺激细胞向 M1 表型发展。我们观察到,与 2D 培养相比,3D 培养中的细胞没有有效极化。我们得出结论,成功极化的细胞数量较少可能不足以改变整体代谢测量。为了证明新型传感系统在微流体研究中的优势,我们专注于更传统的二维培养,并与文献讨论了结果。因此,我们决定在微流控芯片内进行二维动态单层培养。这些结果也促使我们将微流控芯片 A 改为芯片 B。经过 24 小时的刺激,我们通过 qPCR 分析确保 M1 极化的成功。典型 M1 状态标志物 TNFα、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表达水平显着高于对照组。接下来,我们展示了受刺激的细胞实际上完成了从 mRNA 到蛋白质水平的翻译过程。为此,我们通过执行 ELISA 测定了微流控芯片出口处分泌的 TNFα 蛋白的水平。

pH 变化与文献一致:在之前的几项研究中,M1 极化已被证明会导致 pH 水平降低,因为受刺激的细胞具有更高的 ECAR。在我们的研究中,与对照芯片相比,我们能够观察到 LPS 刺激芯片内的 pH 值要低得多。但是当我们查看芯片的初始 pH 值时,它们是不同的。这可能是由于微通道内的气泡形成。气泡会影响芯片介质内的溶解气体浓度,而溶解气体会改变介质的 pH 值。CO 2通过降低 pH 值来影响介质,另一方面,如果介质暴露于富含氧气的气体中,则介质的 pH 值会增加。如果对照介质暴露于 O 2丰富的气泡,这可以解释较高的 pH 值。这种差异还有另一种可能性。设置实验和开始测量大约需要 40 分钟。在测量开始之前将细胞暴露于刺激因子。这可能是由于 LPS 刺激的细胞在刺激后通过 iNOS 的形成降低了培养基的 pH 值[7]。

O 2水平与文献不符:N9 小胶质细胞的 LPS 刺激降低了增殖率并改变了细胞代谢,使其成为糖酵解依赖性。细胞代谢的这些变化导致耗氧量降低,并且由于细胞周期停滞 [9] 与相对较低的细胞数量相结合,LPS 刺激细胞的溶解氧水平测量值预计将高于对照,并且必须具有增加的趋势24小时刺激。我们的结果显示 LPS 刺激细胞的氧水平降低了 7%。必须进行更多的实验以更好地理解为什么会出现这种与文献的分歧。

 

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