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使用SDR®SensorDish阅读器测量叶片O 2消耗率

点击次数:90 发布时间:2020-12-29

     SDR是否可以测量外部代谢产物对叶片O 2消耗率的影响。具体而言,先前在代谢物对叶片O 2消耗速率的影响(使用Astec Global的Q2)中进行了观察,观察到10 mM脯氨酸(Pro)在14小时内引起大约两倍的呼吸速率刺激。该测量的关键方面是持续时间(> 14小时)及其动态性质,因为我们对速率随时间的变化感兴趣。我采用了SDR设置,因此可以测量包含样品的试管顶部空间中的氧气。

背景:需要进行植物呼吸测量

     呼吸通量和光合速率是常规适用于植物的代谢通量测量方法,因此两者都是了解植物生物化学和理学的关键工具。当前存在几种可以测量植物呼吸气体交换速率的技术,例如用于CO 2的红外气体分析仪和用于氧气的Clark型O 2电极。两种技术都具有低通量和持续时间短的测量技术,这阻碍了大规模的实验设计,例如,这些实验设计将用于植物育种者。澳大利亚研究委员会植物能量生物学中心(PEB)一直处于开发和试用用于植物的新呼吸测量技术的前沿。具体来说,使用O2依赖于荧光的猝灭已被用于多种高通量技术,例如SDRSensorDish®Reader,Seahorse或Astec Global的Q2。然而,在植物科学中很少使用这些技术,特别是海马使用漂浮的植物组织的应用受到限制[1]。尽管我们已经尝试过将标准SDR与先前带有传感器斑点的玻璃板结合使用,但是斑点在井底的位置与涉及液体和顶部空间的测量不兼容。目前,PEB的许多呼吸研究均依赖于第二季度。该机器基本上使用自己版本的传感器点,这些传感器点位于顶部螺旋管的盖子和自动传感器臂中。Q2可以很好地与各种植物组织配合使用,并且可以大大提高测量能力,如Scafaro et al。,2017 [2]中所评估。简单的管和盖设置也适用于液体介质的测量。这是一个很大的优势,因为它允许将化学物质引入呼吸测定法,从而大大扩展了其用途[3]。因此,我想测试SDR是否可以与Q2搭配类似的设置(带有管和传感器点帽),以及它是否具有优越的测量性能。

     图1:SDRSensorDish®阅读器设置,用于叶盘呼吸测量。将叶片切开并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管内的缓冲介质上。旋紧瓶盖。顶部机架适配器已放置在上面。特别提款权倒挂。

材料与方法

    实验设置简单,快速(图1)。当总容量为856 µL的塑料螺帽管充满600 µL缓冲溶液(50 mM HEPES,10 mM MES,200 µM CaCl 2,pH 6.6)在存在或不存在10 mM Pro(或所需的任何其他化学物质)的情况下,留有256 µL的空气顶空。将7毫米的叶盘打孔并漂浮在溶液上,并盖上管盖(n = 10)。所有测定中均应包括无叶盘的空白试管,因为它们必须去除大量背景噪音并提高数据质量。然后使用两个3D打印适配器(PreSens)组装SDR。一个SDR大约需要15分钟的设置时间。提供的盖子和管子是高质量的。考虑到适配器的小设计,该单元的组装非常坚固。在室温下黑暗中收集氧气数据。该测定以15秒的间隔进行过夜(〜17小时)。数据已导出到Excel进行分析。

结果

     图2显示了一项实验的氧气测量结果,该实验比较了用SDR记录的未经处理的叶片与经过Pro处理的叶片。这些值用于进一步的消耗率计算。我通过减去无叶盘的空白试管中的平均消耗率来校正O 2消耗率随时间的变化。然后将速率计算为移动1.5小时窗口(图3A-B)。O 2消耗率轨迹随时间的平滑度是用于计算移动斜率的时间窗口的函数:更大的窗口等于更平滑的轨迹。但是,出于本实验的目的,空白消减后残留的噪声不是一个因素。根据Scafaro等人的方法,将O 2百分比转换为摩尔值。2017 [2]。

     图2:用SDR记录的未经处理(左)和经过Pro处理(右)叶盘的氧气测量值。一个实验的数据。经Pro处理的叶盘的刺激呼吸清晰可见。

    结果表明,SDR板与管和盖的设置相结合,再现了以前使用Q2获得的结果。对照叶片中O 2的消耗率随时间逐渐下降(图3A,C)。在Pro处理过的圆盘中,如预期的那样,从开始孵育4小时开始,O 2消耗率随时间增加(图3B,C,D)。在图3D中,我们比较了两种不同的拟南芥基因型。该测定法能够通过重复六次检测先前观察到的品系间表型差异。

资料品质

    关键因素是测量之间的技术差异。与其他呼吸测量设备相比,对照治疗的重复痕迹显示出较低的技术变异:变异系数为22.7%(其中包括生物学变异,因此潜在的技术变异更低)。较低的CV至关重要,因为它使确定具有合理重复次数的样品类型之间的差异变得更加容易。在Pro处理过的叶盘中,由于生物变化,对Pro的响应在叶盘中不太均匀,因此可以预料到Pro处理过的叶盘中O 2消耗率的变化会增加。
    15 s的测量频率足以解决数据中随时间变化的模式。通过将设备放置在培养箱中来控制温度的能力是植物呼吸研究的另一个优势。

    图3:暴露于外源性化学物质时叶盘中O 2消耗率的测定。在有或没有10mM Pro的条件下孵育拟南芥叶盘,并在约15小时的黑暗中测量O 2耗竭率。通过减去含有缓冲液但没有叶盘的四个试管的平均速率来校正速率。(A,B)对照和Pro处理的WT叶盘的单个迹线(n = 10)。(C)来自A和B的平均迹线。(D)来自Pro和对照处理的WT和突变株的平均迹线,相对于未处理的WT速率显示(n = 6)。突变株显示出部分缺乏Pro的呼吸刺激。

 

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